酶聯(lián)吸附法測(cè)定三聚氰胺殘留量的方法。用提取液將樣品中三聚氰胺均質(zhì)振蕩提取樣品。首先將三聚氰胺酶標(biāo)記物、樣品提取液和標(biāo)準(zhǔn)品加入涂有三聚氰胺抗體的微孔開始反應(yīng)。在30分鐘的孵育過程中，樣品提取液中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)，與微孔中的三聚氰胺抗體結(jié)合。孵育30分鐘后，微孔中所有未結(jié)合的三聚氰胺和三聚氰胺酶標(biāo)記物都被沖洗掉。用去離子水洗滌后，在每孔中加入一種清晰的底物溶液，結(jié)合酶標(biāo)儀將無色底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色物質(zhì)。孵育30分鐘后停止反應(yīng)，根據(jù)各孔顏色深度讀取數(shù)據(jù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)顏色，得到樣品中三聚氰胺的濃度值。
一、酶標(biāo)儀檢測(cè)雞蛋中三聚氰胺所需的材料:
1、蒸餾水或去離子水
2、可吸取50ul和100ul的移液器及吸頭
3、4000轉(zhuǎn)離心機(jī)
4、吸水紙或相當(dāng)?shù)奈牧?/span>
5、450nm的酶標(biāo)儀
6、計(jì)時(shí)器
7、20mM PBS：需自行配制
8、清洗液：需自行配制
二、酶標(biāo)儀檢測(cè)雞蛋中三聚氰胺試劑配制：
1、20mM PBS： 0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73g Na2HPO4·12H2O+9g NaCl，蒸餾水定容至1000ml
2、清 洗 液： 0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73g Na2HPO4·12H2O+9g NaCl，蒸餾水定容至1000ml.+0.5ml 土溫20
三、酶標(biāo)儀檢測(cè)雞蛋中三聚氰胺樣品的前處理： 雞蛋（稀釋倍數(shù)：5）
1、稱1g混合好的全蛋，加入5ml的10%甲醇/20Mmpbs，震蕩2min；
2、4000轉(zhuǎn)離心5min；
3、取2ml 上清液加入2ml異辛烷：氯仿（2：3），混勻；
4、4000轉(zhuǎn)離心5min，取上層150ul測(cè)定。
四、酶標(biāo)儀檢測(cè)雞蛋中三聚氰胺的測(cè)定過程:
1. 將所有試劑和樣品放回室溫20-28℃，但時(shí)間不要超過24小時(shí);
2. 從鋁箔袋中取出所需數(shù)量的微孔條，固定在微孔板架上，將未使用的微孔條與干燥劑一起放入密封袋中存放;
3.用吸管將150ul標(biāo)準(zhǔn)品和樣品吸入相應(yīng)的微孔。確保每一種溶液都是用干凈的吸管來繪制的，以避免交叉污染。加入每孔加入50ul三聚氰胺酶標(biāo)記物;
4. 輕輕搖動(dòng)盤子60秒，20-28攝氏度孵育30分鐘;
5. 將微孔中的溶液倒入水槽中，將清洗液填滿微孔，搖勻丟棄，重復(fù)三次，共四次清洗盤子;
6. 清洗一次后，將溶液倒進(jìn)孔中，然后翻轉(zhuǎn)微孔板，在吸水紙上輕拍干燥;
7. 每個(gè)微孔加入100ul底物溶液;
8. 20-28℃孵育30分鐘;
9. 每個(gè)微孔加入100ul停止液;
10. 用萊恩德酶標(biāo)儀在450nm下讀板。
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